<!DOCTYPE html><html lang="en" data-theme="light"><head><meta charset="UTF-8"><meta http-equiv="X-UA-Compatible" content="IE=edge"><meta name="viewport" content="width=device-width, initial-scale=1.0,viewport-fit=cover"><title>蛋白组学技术（二） | 杜鑫辉医生的博客空间</title><meta name="author" content="杜鑫辉"><meta name="copyright" content="杜鑫辉"><meta name="format-detection" content="telephone=no"><meta name="theme-color" content="#ffffff"><meta name="description" content="蛋白组学实验技术（二）1.什么是PRM？ 答： PRM（Parallel Reaction Monitoring，平行反应监测）是一种基于高分辨、高精度质谱的靶向定量技术，能够对目标蛋白质&#x2F;肽段（以及含有修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质&#x2F;肽段的相对&#x2F;绝对定量。 2.PRM绝对定量和相对定量有什么区别？ 答： 蛋白PRM验证可以选择通用的内标肽进行，也可">
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<p>答：</p>
<p>PRM（Parallel Reaction Monitoring，平行反应监测）是一种基于高分辨、高精度质谱的靶向定量技术，能够对目标蛋白质&#x2F;肽段（以及含有修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质&#x2F;肽段的相对&#x2F;绝对定量。</p>
<p><strong>2.PRM绝对定量和相对定量有什么区别？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>蛋白PRM验证可以选择通用的内标肽进行，也可以用合成的目标蛋白的内标肽进行，都可以准确的反映蛋白的含量。其中相对定量用的是通用的内标肽，而绝对定量用的则是合成目标蛋白的内标肽段，每个需要进行验证的蛋白都需要一条特定的内标肽段来对蛋白进行绝对定量。</p>
<p><strong>3.PRM筛选目标肽段，需要用同位素标记吗？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>筛选目标肽段的时候不需要同位素标记。同位素标记的内参是为了定量更准确，如果是相对定量，所有肽段用一条同位素标记内参做校正即可，如果是绝对定量，就需要合成与检测肽段序列一致的同位素肽段。</p>
<p><strong>4.PRM实验时，一般要求提出来的峰丰度达到多少才能做到定量准确呢？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>PRM检测对于峰的丰度来说，没有绝对的标准。在挑选定量肽段时，一般都是尽可能挑丰度高的，但是最主要的指标还是看重复上机以后的RSD偏差值。</p>
<p><strong>5.PRM与标记蛋白质定量技术对比优势是什么？</strong></p>
<p>答： 标记定量（TMT&#x2F;iTRAQ） 是通过大规模采集母离子来扫描蛋白质定性的，可能会出现一些假阳性结果，主要用于前期筛选。而PRM只采集特定母离子，定量准确度更高。</p>
<p><strong>6.一般如何挑选蛋白做PRM？什么蛋白都可以做PRM吗？</strong></p>
<p>答： 一般来讲，我们选择符合实验研究背景的差异蛋白来进行后期的PRM验证比较合适。理论上所有的蛋白都可以用PRM的方法来验证，但是由于蛋白丰度差异很大，丰度低的蛋白很难在质谱中检测到，因此需要对这部分蛋白再进一步评估，同时也可以参考唯一肽段（Unique Peptides）和打分情况。</p>
<p><strong>7.PRM验证时样本还需要生物学重复吗？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>PRM验证依然需要生物学重复，避免样本个体差异带来的影响。</p>
<p><strong>8.转录因子一类的低丰度蛋白可以用PRM做验证吗？组学没检测到这个蛋白，是不是不适合用？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>如果蛋白质组做过深度分级，仍然没有找到该蛋白，那么即使PRM针对性更强，也很大可能检测不到该蛋白。</p>
<p><strong>9.PRM一次最多可以检测多少蛋白？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>目前单次最大通量为100。</p>
<p><strong>10.什么是翻译后修饰？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>翻译后修饰（Post-Translational Modification，PTM）是指对翻译后的蛋白质进行共价加工的过程，通过在一个或多个氨基酸残基加上修饰基团，可以改变蛋白质的理化性质，进而影响蛋白质的空间构象和活性状态，亚细胞定位，折叠及其稳定性以及蛋白质互作。翻译后修饰是增加蛋白质功能多样性的关键机制。</p>
<p><strong>11.修饰组学与常规定量蛋白质组对比主要是哪里不同？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>修饰组学会在酶解后加入一个修饰肽段富集的过程；在数据分析会增加修饰位点鉴定；修饰组学的差异分析基于肽段水平而不是蛋白水平。</p>
<p><strong>12.修饰组为什么是对修饰位点进行定量分析？为什么不是基于蛋白水平？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>一个蛋白质可能同时存在多个修饰位点，蛋白酶解后会产生多个肽段，包括大部分未修饰肽段和少量带修饰基团的肽段。虽然样品在进行质谱分析前已经经过了修饰肽段的富集，但富集的效率并不能达到100%，某些修饰种类的富集效率可能还达不到50%甚至更低，而检测到的非修饰肽段也参与了蛋白质定量，加之富集时损失了大部分的非修饰肽段，所以实际得到的蛋白定量值不能反应生物体内真实的蛋白表达水平。因此，对于修饰Label-free来讲，评价蛋白水平的定量是没有意义的，而是以评价不同样品间特定修饰位点的表达丰度差异为主。</p>
<p>**13.磷酸化蛋白质&#x2F;肽段一般用什么方法富集？ **</p>
<p>答：</p>
<p>a) 固定金属离子亲和色谱法（Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC），金属氧化物富集法。</p>
<p>b) TiO2富集，原理是在酸性条件下TiO2带正电，可以与磷酸化肽产生静电作用而达到吸附的目的。</p>
<p>c) 同时还可以用特异性抗体进行磷酸化富集。</p>
<p><strong>14.N-糖基化位点是如何鉴定的？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>a) 酶解蛋白质；</p>
<p>b) 对N-糖基化修饰肽段进行富集；</p>
<p>c) 用糖苷酶在18O水中切除链接在ASN上的糖链，使ASN分子量增加2.9890Da；</p>
<p>d) 高精度LC-MS质谱检测脱糖后肽段；</p>
<p>e) 检索数据库，确认脱糖后分子量与其理论分子量的变化以及糖基化修饰肽段的序列，从而确定该蛋白质的糖基化位点。</p>
<p><strong>15.修饰蛋白质组可以做PRM吗？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>原则上只要有内标肽段且前期组学能够鉴定到，都是可以通过PRM验证的。但修饰组学的PRM难度更高一些。</p>
<p><strong>16.修饰蛋白组中修饰的肽段是用如何富集的？如果使用抗体会对结果产生影响吗？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>每种修饰的富集方法不同，在富集肽段后会有一个洗脱的过程，这时修饰肽段会与抗体分离，结果不会受影响。</p>
<p><strong>17.细胞凋亡相关的酶能用蛋白组检测吗？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>蛋白组分析结果中会提供KEGG和GO注释，可以在结果中查看有没有蛋白注释到该功能。</p>
<p><strong>18.可以对多肽进行定量检测吗？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>可以用多肽组检测。多肽组是生物体组织或者体液中的全部内源性多肽。多肽组学是以机体内源性多肽和低分子量蛋白质为研究对象，研究多肽组的结构、功能、变化规律及其相关关系。多肽和蛋白质没有明显的界限。通常认为分子量小于10kDa的蛋白质为多肽，多肽组学默认检测6个氨基酸以上的肽段。</p>
<p><strong>19.多肽组学实验流程跟常规蛋白组比有什么区别？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>样本前处理后会有一个多肽分离及富集的过程。多肽组学没有常规蛋白组的质检过程。</p>
<p><strong>20.2-4个氨基酸的小肽可以用多肽组学检测吗？多肽组学能检测的肽段范围？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>不可以。多肽组学默认检测6个氨基酸以上（常见6-80左右个氨基酸），分子量小于10kDa的多肽。</p>
<p><strong>21.做PRM需要准备什么？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>需要明确所有目标蛋白，提供目标蛋白或肽段的具体信息（数据库登陆号或氨基酸序列）。</p>
<p><strong>22.如果需要对多个蛋白进行绝对定量，那么每个蛋白都需要合成一条独特的同位素肽段来进行绝对定量吗？</strong><br>答：</p>
<p>是的，绝对定量需要根据蛋白单独合成独特的同位素肽段。</p>
<p><strong><font color=red>23.胶条鉴定样本如何取样、送样？</font></strong></p>
<p>答：取样：送考马斯亮蓝染色或银染后的胶点&#x2F;胶条，要求条带清晰，无降解。注：</p>
<p>a) 考马斯亮蓝染色的条带鉴定到目标蛋白的概率高于银染；</p>
<p>b) 只鉴定目的条带，可将目的条带切下放入EP管中；</p>
<p>c) 如果是胶条，可将整条泳道切下放入EP管中。</p>
<p>送样：切取目的条带后，加几滴双蒸水没过条带，冰袋寄送，4℃保存</p>
<p><strong>24.胶条鉴定样本的数量如何计算？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>放在一根EP管里算一个样本。举个例子：有两根条带，放在1根EP管中，算一个样本。如果想测全泳道就切下泳道放置在一根EP管中。</p>
<p><strong><font color=red>25.采样过程中有哪些注意事项？哪些成分不能与质谱兼容？</font></strong></p>
<p>答：</p>
<p>蛋白质组学中，不建议在样品收集的过程中采用蛋白酶体抑制剂；同时，在准备样品时，尽量避免使用使用含有NP-40, Triton X-100，Tween 20、80，高浓度SDS等的溶剂或提取剂；贴壁细胞收集时不建议采用胰酶消化。</p>
<p><strong>26.蛋白质降解的可能原因有哪些？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>a) 样本收集过程中处理不当，如样本收集操作时间较长、引入了较多杂质（如发酵液引入）、植物根叶清洗后没有吸收多余的水分、处理过程温度较高等；</p>
<p>b) 样本制备过程中出现降解，如样本制备操作时间较长；</p>
<p>c) 样本反复冻融。</p>
<p><strong><font color=red>27.什么是高丰度蛋白？</font></strong></p>
<p>答：</p>
<p>高丰度蛋白指在总蛋白提取物中含量很高的蛋白；与此相对应低丰度蛋白指在总蛋白提取物中含量很低的蛋白。高丰度蛋白会影响质谱的结果，使低丰度蛋白在质谱检测中较难被检测到。这类蛋白的表达丰度可以在SDS-PAGE结果中直观地体现。</p>
<p><strong>28.如何来判断提取的蛋白是否可以用于后续的质谱检测？</strong></p>
<p>答：</p>
<p>a) 看SDS-PAGE电泳图结果中蛋白条带分布，要求蛋白条带清晰且分布均匀；</p>
<p>b) 同时需要关注SDS-PAGE电泳图样品的平行性，组内样本需要平行性良好；</p>
<p>c) 根据SDS-PAGE结果估算提取的蛋白总量，一般普通蛋白质组学的蛋白总量需要在200ug以上，修饰组学需要根据具体的修饰类型适当增加蛋白总量；</p>
<p>d) 提取的蛋白浓度不宜过低。</p>
</article><div class="post-copyright"><div class="post-copyright__author"><span class="post-copyright-meta">Author: </span><span class="post-copyright-info"><a href="https://gitee.com/drduxinhui">杜鑫辉</a></span></div><div class="post-copyright__type"><span class="post-copyright-meta">Link: </span><span class="post-copyright-info"><a href="https://gitee.com/drduxinhui/2023/10/05/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E7%BB%84%E5%AD%A6%E6%8A%80%E6%9C%AF%EF%BC%88%E4%BA%8C%EF%BC%89/">https://gitee.com/drduxinhui/2023/10/05/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E7%BB%84%E5%AD%A6%E6%8A%80%E6%9C%AF%EF%BC%88%E4%BA%8C%EF%BC%89/</a></span></div><div class="post-copyright__notice"><span class="post-copyright-meta">Copyright Notice: </span><span class="post-copyright-info">All articles in this blog are licensed under <a target="_blank" rel="noopener" href="https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/">CC BY-NC-SA 4.0</a> unless stating additionally.</span></div></div><div class="tag_share"><div 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title="蛋白组学技术（一）"><div class="cover" style="background: var(--default-bg-color)"></div><div class="pagination-info"><div class="label">Next Post</div><div class="next_info">蛋白组学技术（一）</div></div></a></div></nav></div><div class="aside-content" id="aside-content"><div class="card-widget card-info"><div class="is-center"><div class="avatar-img"><img src="https://i.imgs.ovh/2023/10/04/V4AVR.th.jpeg" onerror="this.onerror=null;this.src='/drduxinhui/img/friend_404.gif'" alt="avatar"/></div><div class="author-info__name">杜鑫辉</div><div class="author-info__description"></div></div><div class="card-info-data site-data is-center"><a href="/drduxinhui/archives/"><div class="headline">Articles</div><div class="length-num">47</div></a><a href="/drduxinhui/tags/"><div class="headline">Tags</div><div class="length-num">0</div></a><a href="/drduxinhui/categories/"><div class="headline">Categories</div><div class="length-num">0</div></a></div><a id="card-info-btn" target="_blank" rel="noopener" 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  const $mermaid = document.querySelectorAll('#article-container .mermaid-wrap')
  if ($mermaid.length === 0) return
  const runMermaid = () => {
    window.loadMermaid = true
    const theme = document.documentElement.getAttribute('data-theme') === 'dark' ? 'dark' : 'default'

    Array.from($mermaid).forEach((item, index) => {
      const mermaidSrc = item.firstElementChild
      const mermaidThemeConfig = '%%{init:{ \'theme\':\'' + theme + '\'}}%%\n'
      const mermaidID = 'mermaid-' + index
      const mermaidDefinition = mermaidThemeConfig + mermaidSrc.textContent

      const renderFn = mermaid.render(mermaidID, mermaidDefinition)

      const renderV10 = () => {
        renderFn.then(({svg}) => {
          mermaidSrc.insertAdjacentHTML('afterend', svg)
        })
      }

      const renderV9 = svg => {
        mermaidSrc.insertAdjacentHTML('afterend', svg)
      }

      typeof renderFn === 'string' ? renderV9(renderFn) : renderV10()
    })
  }

  const loadMermaid = () => {
    window.loadMermaid ? runMermaid() : getScript('https://cdn.jsdelivr.net/npm/mermaid/dist/mermaid.min.js').then(runMermaid)
  }

  btf.addModeChange('mermaid', runMermaid)

  window.pjax ? loadMermaid() : document.addEventListener('DOMContentLoaded', loadMermaid)
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